前列腺癌中基质金属蛋白酶7，9的表达及其与VE
时间：2016-02-26 14:02
前列腺癌中基质金属蛋白酶7，9的表达及其与VEGF的关系
作者：周洪澜 邢春伟 葛岩 王心蕊 王医术
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶7，9在前列腺癌转移侵袭中的作用，以及VEGF与基质金属蛋白酶的关系。方法 采用免疫组织化学和形态定量分析方法分析MMP7及MMP9表达情况，同时培养PC3M细胞并采用Boyden小室侵袭试验及酶谱分析观察MMP9及其与VEGF在前列腺癌中的作用。结果 前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P<0001)。boyden小室侵袭实验显示，不同试验组穿透matrigel的细胞数依次递减，即pc3m> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50)，均有显坐的统计学差异(P<001)。酶谱分析观察发现，直接培养于培养皿表面的pc3m 细胞仅有稳定的mmp9和mmp2酶原表达，但pc3m细胞与vegf共孵育组条件培养基中mmp9酶原含量以vegf剂量依赖的方式增加。结论 mmp7和mmp9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。vegf与mmps的分泌有关，其机制有待于进一步探讨。<>
【关键词】 前列腺癌;基质金属蛋白酶;血管内皮细胞生长因子
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)生物学效应贯穿于肿瘤发展的各个环节〔1，2〕。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种与肿瘤发生、发展密切相关的生长因子，可通过细胞内信号转导的级联放大效应而调节MMPs的产生与活化〔3，4〕，使得细胞外基质(ECM)处于不断地合成与分解代谢的动态平衡中，这种动态平衡的稳定是维持组织细胞结构和功能的重要基础。本研究以前列腺癌作为研究对象，探讨前列腺癌中金属蛋白酶与肿瘤转移侵袭的关系，以及金属蛋白酶和VEGF的关系。
1 材料与方法
11 材料
所有前列腺癌材料取自手术切除的新鲜组织，共计34例，其中5例Gleason Grade 2，9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4，6例Gleason Grade5。5例正常前列腺组织取自意外死亡的正常男性青年。所有标本均经严格筛选并经病理诊断证实。体外培养前列腺癌细胞PC3M由吉林大学基础医学院病理生理学教研室惠赠;NIH3T3细胞由吉林大学第三临床学院中心实验室惠赠。
12 免疫组织化学染色
免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连接法(SP法)。所用一抗(MMP7，9，13)、二抗、三抗及DAB均购自迈新公司。步骤如下：梯度脱水、脱蜡，过氧化物酶(A液)阻断15 min，非免疫动物血清(B液)封闭;加入一抗，4℃过夜后;加生物素标记二抗(C液)30 min，滴加链亲和素过氧化物酶溶液(D液)30 min;DAB发色，水洗终止;苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树胶封片。
13 形态定量方法
通过Cooled CCD采集预计数视野图片，而后采用ImagePro Plus Analysis Software分析表达阳性的切片。
14 细胞培养
在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培养液中培养人前列腺癌细胞PC3M。
15 Boyden小室肿瘤侵袭试验
NIH3T3条件培养液的制备：铺Matrigel基膜胶，收集前列腺癌细胞，向小室上室内加入100 μl癌细胞悬液，于37℃，5%CO2条件下孵育4～6 h，醋酸酒精甲醛固定液固定20 min，HE染色，中性树胶封片。侵袭细胞的计数：在400×视野下任取10个不重复视野，利用目镜测微尺计数每个视野穿透Matrigel基膜胶下室面的肿瘤细胞数目，计算平均值。
16 酶谱分析
酶谱分析基本步骤：配制含1 mg/ml明胶的10%SDSPAGE底物;将已制好的浓缩蛋白样品不经加热直接上样;以5 mA/gel电泳，当样品进入分离胶后，将电泳电流提高到10 mA/gel;电泳完成后，将底物胶置于孵育缓冲液中37℃缓慢摇摆18 h，以使待测MMPs充分作用于底物;孵育结束后经考马斯亮蓝染色30 min及脱色液(45%甲醇，10%冰乙酸)脱色60 min，观察结果。利用图像分析软件对酶谱分析结果进行灰度扫描。利用紫外分光光度法测蛋白质含量，每组细胞设3个平行样本，组织酶谱分析重复多次观察。具体步骤：电泳、封胶后，利用图像分析程序，读取图像反转膜式后各消化条带的灰色度及面积，计算各条带的酶含量。酶含量=条带面积×(条带灰度减于背景灰度)，将所得值再换算成单位蛋白表达量作为最终测得的酶含量值，从而对各组细胞的酶活性进行定量比较。
17 统计学处理
所有统计均由INSTAT统计软件包完成。两组间均数采用t检验。
2 结果
21前列腺癌中MMP7和MMP9的表达
5例正常前列腺组织中，MMP7和MMP9均为3例阳性表达和2例阴性表达。前列腺癌中MMP7和MMP9均阳性表达，其蛋白均主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中，部分间质细胞和血管内皮细胞也呈阳性表达(图1)，MMP7灰度值为32 047 930±9 499 987，MMP9灰度值为23 873 011±14 414 601。前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P<0001)(图1)。<>
22 Boyden小室侵袭实验
在Boyden小室的上室内分别加入前列腺癌细胞PC3M，PC3M+MMP9Ab (1∶100)，PC3M+MMP9Ab (1∶50)，结果显示，穿透Matrigel的细胞数依次递减，即PC3M> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50)，均有显著学差异(P<001)(图2)。<>
23 酶谱分析结果
见图3。酶谱分析观察发现，直接培养于培养皿表面的PC3M 细胞仅有稳定的MMP9(92 kD)(12 064±874), MMP2(72 kD)酶原表达，但PC3M细胞与VEGF共孵育组，条件培养基中MMP9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加〔30 ng/ml：51 0758±1 128，10 ng/ml(254 352±1 019)〕(P<0001，表1)。<>
3 讨 论
31 MMPs与前列腺癌侵袭、转移的关系
ECM是癌细胞侵袭和转移的主要防御屏障，癌细胞从病灶原位向周围组织间隙侵袭必须首先突破ECM，因此ECM与癌组织的生物学行为及预后密切相关〔5〕。MMPs主要通过降解ECM、释放和/或活化生长因子、参与肿瘤血管的生成等，从而在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用〔6〕。在MMPs家族中MMP9属于明胶酶类，也称Ⅳ型胶原酶(collagenase)，因其参与ECM的主要成分Ⅳ型胶原的降解，在肿瘤的血管新生、肿瘤细胞的侵袭和转移灶的形成等过程中扮演着重要的角色〔7〕。研究证实，在许多上皮源性恶性肿瘤中，发现有MMP9的表达和(或)活性增强〔8〕， Davies等〔9〕在膀胱肿瘤组织中也检测到了MMP9，且明显高于正常对照组，但目前关于MMP9在前列腺癌中的表达情况鲜有报道。MMP7亦称基质溶素，属于间质溶素类，其主要作用底物为层黏连蛋白(LN)、纤维蛋白、蛋白多糖和核心蛋白。而LN亦为ECM的主要成分。既往研究已发现，LN作为构成细胞外基质主体结构的糖蛋白，首先介导了肿瘤细胞对基底膜的附着，然后在瘤细胞分泌的蛋白溶酶作用下发生分解，形成一个解剖上的植入点，使肿瘤细胞得已突破基质膜发生侵袭和转移〔10〕。本研究显示，正常前列腺组织中MMP7和MMP9不表达或微量;前列腺癌中MMP7和MMP9的蛋白均主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中，部分间质细胞和血管内皮细胞也呈阳性表达，且MMP7和MMP9的表达随着前列腺癌分级的增高而增强，各组间均有显著性差异(P<0001)。在boyden小室侵袭实验中，我们在上室内分别加入前列腺癌细胞pc3m，pc3m+mmp9ab (1∶100)，pc3m+mmp9ab (1∶50)，结果显示，穿透matrigel的细胞数依次递减，即pc3m> PC3M+MMP9Ab (1∶100)> PC3M+MMP9Ab (1∶50)，表明当MMP9被其抗体中和而数量减少时，其侵袭作用减弱，也因此说明MMP9在肿瘤侵袭中具有重要作用。我们认为MMP7和MMP9确可降解基膜，且随着肿瘤恶性程度的提高，此种降解作用逐步增强，肿瘤侵袭和转移的能力必将增强。MMP7和MMP9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。<0001)。在boyden小室侵袭实验中，我们在上室内分别加入前列腺癌细胞pc3m，pc3m+mmp9ab (1∶100)，pc3m+mmp9ab (1∶50)，结果显示，穿透matrigel的细胞数依次递减，即pc3m>
32 VEGF对前列腺癌细胞表达MMPs的作用及意义
近年来，研究人员已逐渐开始关注VEGF和MMPs的关系。有报道发现VEGF可显著刺激血管壁平滑肌细胞产生并分泌MMP9与MMP1，其信号转导途径依赖于VEGFR1〔11〕。在乳腺癌细胞的明胶酶谱分析实验和免疫印迹实验中，也发现PC细胞分化生长因子(PCDGF/GP88)可刺激VEGF的释放，并上调MMP9，由此认为MMP9和VEGF间存在一定联系〔12〕。还有文献报道，在肾细胞癌中，MMP9和VEGF的表达呈正相关，MMP9和VEGF的协同作用影响肾细胞癌的血管生成〔13〕。因此，可以认为VEGF和MMPs可能存在某种相互作用。为明确VEGF对MMPs产生、分泌与活化的影响，我们利用酶谱分析的方法设计了一组癌细胞条件培养基的对照实验。发现直接培养于培养皿表面的PC3M细胞有稳定的MMP9和MMP2酶原表达，而PC3M细胞与VEGF共孵育组，条件培养基中MMP9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加，结果证实VEGF确与MMPs的分泌有关，VEGF可刺激MMPs的分泌、表达，因而在肿瘤的侵袭中扮演重要角色，其作用机制还有待于进一步探讨。本研究通过MMPs和VEGF在前列腺癌中的表达情况，探讨二者在前列腺癌侵袭和转移过程中的作用及意义。为临床寻求有效治疗前列腺癌的新方法，预防和减少前列腺癌的侵袭和转移、提高治愈率提供了可靠的理论基础。
<0001，表1)。<>
<001)(图2)。<>
<0001)(图1)。<>
<001)。酶谱分析观察发现，直接培养于培养皿表面的pc3m 细胞仅有稳定的mmp9和mmp2酶原表达，但pc3m细胞与vegf共孵育组条件培养基中mmp9酶原含量以vegf剂量依赖的方式增加。结论 mmp7和mmp9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。vegf与mmps的分泌有关，其机制有待于进一步探讨。<><0001)。boyden小室侵袭实验显示，不同试验组穿透matrigel的细胞数依次递减，即pc3m>
携康国际是中国最早从事海外医疗行业的公司之一，也是为国内患者提供出国看病、国际远程会诊、国内外早癌高端筛查体检、心脏疾病治疗等全方位信息咨询与服务的权威机构。八年来，携康国际已经帮助上千名患者实现“健康之旅”，合作先进的国外医疗资源：德国慕尼黑质子中心；日本国立癌症中心、德洲会医院集团、福冈山王医院、藤田保健卫生大学医院；美国麻省总医院、丹娜法伯癌症研究院、西达赛奈医疗中心；法国居里研究所等，并且提供快捷的国外专家预约、医院预约、辅助办理出国手续、医学资料收集和翻译以及海外治疗陪同翻译等所需的全程服务。
携康国际将以更专业的态度为中国患者带来贴心服务。
出国诊疗和体检官方电话：400-067-0509。
相关文章
前列腺癌中基质金属蛋白酶7，9的表达及其与VEGF的关系 作者：周洪澜邢春伟葛岩王心蕊...
125碘粒子植入联合射频消融前列腺癌治疗术后PSA变化 作者：陈光春吴开俊李逊袁坚曾国...
碱性成纤维细胞生长因子在前列腺癌和良性前列腺增生组织中表达的意义 作者：刘艳波 沈...
前列腺癌基因诊断最新进展 作者：王健琪 前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，...
前列腺癌新辅助治疗临床分析 作者：刘定益，唐崎，王 健，王名伟，刘世雄，周文龙，祝...
携康国际咨询 400-811-5152 ｜京ICP备09071895号
