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PTTG、VEGFC 的表达及微淋巴管密度与非小细胞肺癌

时间：2017-06-24 17:39

　　PTTG、VEGFC 的表达及微淋巴管密度与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

　　作者：尹秋伟 郭旭峰 胡国强 赵健 李希波

　　【摘要】 目的 检测非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)、癌旁组织及肺良性病变组织中垂体瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene,PTTG)及血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor，VEGFC)的表达和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)值，并探讨三者间的相互关系。方法 应用实时荧光定量 PCR 和免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌组织中 PTTG、VEGFC mRNA 和蛋白及 LMVD 的表达，分析 PTTG、VEGFC 及 LMVD 与 NSCLC 临床病理特征的关系，以及 PTTG、VEGFC 和 LMVD 三者之间的相互关系。同时，对随访资料进行生存分析，绘制生存率曲线，探讨 PTTG、VEGFC 对肺癌患者预后的影响。结果 PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 值在不同性质的肺病变组织中的表达均有显著性差异(P均<005)，在不同年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、组织学类型及分化程度间无显著性差异(P均>005)，在TNM分期、淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均<005)。PTTG、VEGFC 蛋白表达在淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均<005)。生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者生存时间均短于低/无表达者(P=0030，0027，n=65)。PTTG 在肺癌组织中的表达与 VEGFC、LMVD 密切相关，随着 PTTG 强度增加，VEGFC 分级及 LMVD 值亦增加。结论 PTTG、VEGFC 的过度表达促使肿瘤微淋巴管的生成，进而促进了肿瘤细胞淋巴结转移。PTTG 和 VEGFC 表达可作为判断 NSCLC 生物学行为及肺癌患者预后的良好指标，VEGFC 有望成为肺癌抗淋巴管治疗的新靶点。

　　【关键词】 垂体瘤转化基因;血管内皮生长因子C;微淋巴管密度;实时荧光定量PCR

　　垂体瘤转化基因(PTTG)是1997年〔1〕 被发现并证实与细胞增殖、分化和凋亡有关的癌基因。血管内皮生长因子(VEGF)C 被认为是迄今发现的唯一特异性新生淋巴管刺激因子,可促进肿瘤微淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结转移。有研究〔2〕 显示 PTTG 可通过促进 VEGFC 的过度表达，促使肿瘤细胞发生淋巴结转移。国内外已报道 PTTG 在食管癌、胃癌和卵巢癌等多种肿瘤中高表达，但目前尚未见对 PTTG 在肺癌中表达研究的报道。以往关于 VEGFC 的研究多为蛋白半定量分析，本实验结合免疫组化应用实时荧光定量 PCR 对非小细胞肺癌(NSCLC)组织中 PTTG、VEGFC 的表达进行精确定量分析，并检测微淋巴管密度(LMVD)的表达情况,旨在探讨它们与 NSCLC 临床病理特征及预后的关系。

　　1 材料与方法

　　11 研究对象

　　收集65例 NSCLC 组织，均来自手术切除且经病理科常规病理学检查证实。男∶女为40∶25，年龄43～78(中位数588)岁。依据1997年新的修订标准进行TNM分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例;按病理形态学分为鳞状细胞癌36例，腺癌26例，大细胞癌3例;按分化程度分为高分化5例，中分化18例，低分化42例;按有无淋巴结转移分为有淋巴结转移37例，无淋巴结转移28例。所有患者均为原发性 NSCLC，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。同时取65例配对的癌旁组织和20例肺良性瘤样病变组织(包括结核球10例，错构瘤4例，炎性假瘤4例，肺纤维组织细胞瘤1例，肺隐球菌感染1例)。癌旁组织为距肿块边缘5 cm以上的正常组织。肺癌组织和肺良性病变组织均取自肿块中央非坏死部分。标本经10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。65例患者无住院期间死亡，随访日期以患者手术日期起计算，术后随访至2006年5月。

　　12 实验用品

　　RNAiso Reagent、SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(DRR053S) 均购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。采用ABI PRISM 7000 实时 PCR扩增仪。兔抗人多克隆抗体 PTTG、VEGFC、VEGFR3及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。

　　13 实验方法

　　131 实时荧光定量

　　1311 总RNA的提取

　　每100 mg组织匀浆后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入02 ml氯仿，离心后吸取上清，加入05 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能残余的基因组DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛变性凝胶电泳，分光光度计检测浓度和纯度。

　　1312 cDNA的合成

　　反转录仪为 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反转录反应体系，4μl 溶解于去RNA酶的双蒸水，05μl 随机引物(100 μmol)，2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase(200 U/μl)，025 μl RNA酶抑制剂(40 U/μl)，05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸馏水至10μl。反应条件：42 ℃15 min(反转录反应);95℃2 min(反转录酶的失活反应)。

　　1313 荧光定量PCR扩增

　　引物：由TaKaRa公司提供的高特异性引物, PPTG 上游引物序列5′CCTCAGATGAATGCGGCTGTTA3′，下游引物序列5′AGCTTCAGCCCATCCTTAGCAA3′，扩增片段为118 bp。VEGFC 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG3′，下游引物序列5′TTTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，扩增片段为115 bp。荧光定量 PCR 仪为ABI PRISM 7000实时PCR扩增仪(Applied Biosystems公司)，用荧光染料SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行PCR扩增。采用20 μl反应体系，包括2 μl cDNA溶液，特异性上下游引物各04 μl(10 μmol)，04 μl ROX 参照染色(50×)，SYBR Premix Ex TaqTM (2×)10μl，dd H2O(灭菌蒸馏水)68 μl。采用两步法 PCR 扩增标准程序：预变性95 ℃10 s;PCR反应95℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环,历时1 h 37min。

　　1314 数据收集处理和分析

　　荧光定量 PCR 结果用7000 序列检测系统软件输出Ct值，参照2ΔΔCt 数据分析法〔3〕进行相对定量计算。

　　132 免疫组化法

　　1321 检测 PTTG、VEGFC 蛋白表达

　　采用免疫组化 Wax Envision 多聚复合物酶标法，具体步骤按照试剂盒说明书进行。阴性对照采用001 mol/L PBS代替一抗。

　　1322 结果判定

　　参照 Vlom 等〔4〕 的评判标准：PTTG、VEGFC 蛋白染色阳性为胞浆呈清晰棕黄色颗粒，每张 PTTG 切片在400倍显微镜下选定l0个视野，计算阳性细胞的百分数，胞浆染色阳性的细胞百分率 <5% 为“-”，5%～24% 为“+”，25%～50% 为“”，>50% 为“”。VEGFC 切片以400倍视野下着色细胞占视野细胞总数的多少分为0～3级：0级，0;1级，<25%;2级，26%～50%;3级，>50%。0级为阴性，1级或1级以上为阳性。

　　1323 LMVD 计数方法参照Weidner 等〔5〕的标准

　　先在光镜低倍(×40)视野下寻找癌周组织微淋巴管最密集区即热点(hotspot)，然后在100倍视野下观察着色的管腔及细胞丛，并以此作为一个微淋巴管。一张切片计数3～5个 100倍视野内的淋巴管数，取其平均值为微淋巴管数。

　　1324 生存分析

　　通过绘制生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者与低/无表达者生存时间的差别。

　　14 统计学分析

　　应用SPSS130软件包。计量资料采用t检验、单因素方差分析和q检验，计数资料采用χ2检验及多个独立样本秩和检验(Kruska1Wallis Test)。对生存数据采用 KaplanMeier 分析并绘制生存曲线，用Logrank检验差异性。

　　2 结 果

　　21 PTTG、VEGFC mRNA 和LMVD在肺癌组织、癌旁组织和肺良性病变组织中的表达PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 值在不同性质的肺病变组织中的表达均有显著性差异(P均<005)(表1)。

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